试剂盒组分
| 货号 | 组方A | 组方B |
| 415S | 40 μL | 20 mL |
| 415M | 100 μL | 50 mL |
| 415L | 200 μL | 100 mL |
背景
从细胞或组织中提取到完整的蛋白质样品是影响免疫印迹分析（Western blotting，WB）得到真实可靠结果的关键因素之一。在实际操作中，从细胞膜、细胞质、细胞器及细胞核中提取蛋白质通常采用去污剂缓冲液（如RIPA缓冲液）和/或物理破碎（如超声处理）的方法；尤其，含有0.1% SDS的RIPA缓冲液或其替代品（如不含SDS的NP-40缓冲液）已作为一种标准方法被广泛用于哺乳动物细胞和组织的裂解。事实上，RIPA可以有效溶解和提取分子量小于90 kDa的中、小分子的绝大部分的蛋白质，但其对于分子量大于90 kDa的大分子蛋白质功效不大。为了更有效地提取到大分子蛋白，许多实验室会将RIPA缓冲液和超声处理结合使用，通过超声打断DNA，从而降低裂解液的粘稠度。然而，超声处理会破坏大分子蛋白。此外，为了保证蛋白质在提取的过程中不被细胞本身的蛋白酶降解和蛋白酶去修饰，各种蛋白酶抑制剂和特异的酶抑制剂要加到RIPA缓冲液中。例如，为了减少蛋白质的降解，需要将蛋白酶抑制剂如PMSF添加到RIPA缓冲液中；同样，为了抑制磷酸酶活性，需加入氟化钠和正钒酸钠。即便如此，翻译后修饰的蛋白信号还是不能得到有效的保护。
合肥善本的IntactProteinTM全能型蛋白抽提试剂盒解决了以上问题和缺陷。它可以快速完整的提取细胞和组织中蛋白质，并有效保护蛋白质的化学修饰，可以取代现有的RIPA及其衍生的缓冲液，具有通用性好、应用广泛、实用高效等优点，同时，该裂解试剂盒在提取蛋白质时无需额外添加蛋白酶、磷酸酶以及其它酶抑制剂，无需超声波处理，不仅可以完整提取分子量大于90 kDa的大分子蛋白质，而且对小于90 kDa的蛋白质分子应用同样有效，大大简化了实验流程，节约时间和材料成本，从而在源头上为下游的蛋白质分析提供了优质完整的蛋白质样品。
产品特性
无需添加蛋白酶或其他酶抑制剂或超声处理。
只需混合组方A和B；提取过程仅需15分钟。
接近完整地抽提大分子蛋白质；无超声处理，避免蛋白质片段化。
保护蛋白质翻译后修饰（如磷酸化、糖基化、泛素化、甲基化和乙酰化）无损失。
适用于哺乳动物细胞和组织的提取。
储存
组方 A 存放于-20 ℃ 冷冻条件，保质期一年；
组方 B存放于4 ℃ 冷藏条件，保质期一年。
注：
组方B可在室温条件下保存3个月，若要长期保存，请存放于4 ℃；
若组方B在 4 ℃ 下长时间保存，可能会出现沉淀；
沉淀不影响产品质量；
沉淀在室温条件下会重新溶解，当沉淀消失后，轻轻混合溶液。
应用
变性蛋白的提取；免疫印迹
贴壁细胞实验方案
1、按500体积组方B加1体积组方A（500:1）充分混匀，制备成组方A+B的工作裂解液IntactProteinTM置于冰上备用。注意：根据步骤3提前计算您需要的裂解液的体积。
2、弃去细胞培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
3、将培养皿/培养板置于冰或冰水中，按 5x10⁶ 细胞添加1 mL裂解液（例如，将200 µL裂解液加入到含有1x10⁶ 细胞的35 mm培养皿中）。将培养皿/培养板在冰上再放置5分钟，偶尔左右旋转以使裂解液完全覆盖细胞。
4、裂解5分钟后，使用干净的塑料刮刀将细胞从培养皿/培养板上刮下，并将裂解物收集到离心管中。
5、彻底涡旋混匀裂解物（3×10秒），并将裂解物置于冰或冰水中再放置10分钟以完全裂解。
6、在95 ℃ 加热裂解产物5分钟。
7、将裂解产物放在冰或冰水中冷却3分钟。
8、在4 ℃ 以13,000 g离心裂解产物5分钟，将提取的蛋白质的上清液转移到干净的离心管中。
9、使用分光光度计或SDS兼容的蛋白质浓度测定试剂盒测量蛋白质浓度。
10、将裂解产物分装并储存在-20 ℃ 备用。注意：如果免疫印迹分析采用还原SDS-PAGE胶，必须向裂解物中添加终浓度为 2–5%的β-巯基乙醇或50 mM DTT，外加0.1%的溴酚蓝。上样前应将样品在 95 ℃ 下加热5分钟。
悬浮细胞实验方案
1、如贴壁细胞实验方案步骤1所述，在使用前立即准备组方A+B工作裂解液。
2、将悬浮细胞以300 g离心5分钟，弃去上清，然后用10 mL冰冷的PBS重悬细胞。再次离心，弃去PBS，用移液器将细胞重悬到残留的PBS 中。
3、按5x10⁶ 细胞加入1 mL裂解液（例如，将200 µL裂解液加入到含有1x10⁶ 细胞的35 mm培养皿中），通过移液器充分混匀，然后置于冰或冰水中5分钟。
4、按照贴壁细胞实验方案中的步骤 5-10 进行操作。
组织蛋白抽提方案
1、如贴壁细胞实验方案步骤1所述，在使用前立即准备组方A+B工作裂解液。
2、在液氮中，使用研钵和杵将组织研磨成细颗粒。
3、按照1 g组织使用3 mL（例如，将600 µL裂解液加入到0.2 g组织中）裂解液的比例，将冷冻组织粉末加入裂解液中。
4、按照制造商的说明使用匀浆器对组织进行匀浆。（注：匀浆会加热样品，匀浆时务必始终将管子底部放在冰上或冰水中）。
5、在冰上孵育匀浆样品须> 15分钟以达到完全裂解（注：如果实验同时有多个样品，请将所有匀浆样品放在冰上，直到完成最后1个样品）。
6、最后一个样品匀浆15分钟后，在4 ℃ 下以13,000 g 离心10分钟。将提取的蛋白质的上清液转移到干净的离心管中。
7、按照贴壁细胞实验方案中的步骤6-10 进行操作。
