善本生物

Western blot中文名称是免疫印迹或蛋白免疫印迹，简称WB。它是基于抗原抗体特异性结合反应检测/分析样品中某种目标蛋白信号分子表达状态。换言之，它是采用凝胶电泳将细胞或生物组织样品中分子量和带电荷不同的蛋白质信号分子分离开，然后将凝胶中的蛋白信号分子转移到硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜或聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride，PVDF）膜上，接着利用特异性抗体与膜上相应抗原—蛋白信号分子经杂交结合、发光/显色、分析发光/显色的位置和强度/深浅，确定目标蛋白信号分子的表达情况。

WB是实验室对蛋白信号分子检测最常用方法之一，选取和处理制备好样品对获得精确实验结果至关重要。当WB实验中出现无蛋白信号（白片）、目的蛋白信号条带弱、或整个膜背景过高时，通常想到的是查找实验操作和/或特异性抗体可能有问题，而样品—目标蛋白信号自身的特性之选取及其处理是否有问题却被忽略了。为此，本文就WB实验异常与样品关系做如下解析。

1  样品选取的重要性

高质量的样品是获得可靠结果的基础；降解或污染的样品会导致条带不清晰或假阳性/假阴性结果；样本应能准确反映研究目标。如果选取的细胞或组织中目标蛋白信号分子不表达、或目标蛋白信号表达量偏低、或某些目标蛋白信号分子不表达需要特定诱导刺激才能够检测到它的表达就会导致WB实验显现白片或目的条带弱的结果。

下面用UCHL1、CD4和PARP1三个信号分子为例，展示选取合适样品及添加阳性对照的重要性。

1.1  选取的细胞或组织中目标蛋白信号分子不表达

首先，可以利用https://www.proteinatlas.org/网站、Uniprot或参考文献等数据库资源，查阅并确认目标蛋白信号分子是否在你的实验样品—细胞或组织中表达。值得注意的是，各种细胞或组织中的目标蛋白信号分子具有特异性表达属性，如果选取的样品恰巧没有目标蛋白信号分子表达，WB实验最后的结果就可能是白片。例如UCHL1在HT-080细胞（图1）、HeLa细胞（图2）中不表达，WB实验结果就没有目标蛋白信号（见图3）。

图1  各种细胞中UCHL1表达情况，HT-1080细胞不表达

 

图2  各种细胞中UCHL1表达情况，HeLa细胞不表达

图3  WB检测细胞和组织中UCHL1表达，HT-080和HeLa细胞无表达

1.2  选取的细胞或组织中目标蛋白信号分子表达低

首先，可以利用https://www.proteinatlas.org/网站、Uniprot或参考文献等数据库资源，查阅并确认在不同细胞或组织中目标蛋白信号分子表达量高低不同。如果选取的细胞或组织中目标蛋白信号分子表达量偏低，WB实验最后的目的条带结果会很弱，甚至检测不到信号。值得注意的是，采用已确定表达目标蛋白信号分子的样品作为阳性对照，对于排除条带弱的实验问题非常有效。例如在

HT-1080细胞（图4）、Ramos细胞（图5）和HAP-1细胞（图6）中CD4表达量低，WB实验最后的目的条带结果就会很弱、或高背景、或白片（图7）。

 

图4  各种细胞中CD4表达情况，HT-1080细胞表达低

图5  各种细胞中CD4表达情况，Ramos细胞表达低

图6  各种细胞中CD4表达情况，HAP-1细胞表达低

 图7  WB检测细胞中CD4表达，HT-080、Ramos和HAP-1细胞表达很弱

1.3  选取的细胞或组织经诱导剂刺激后目标蛋白信号分子表达

首先，可以利用https://www.proteinatlas.org/网站、Uniprot或参考文献等数据库资源，查阅并确认目标蛋白信号分子是否需要诱导刺激才能够表达。在正

常细胞或组织中有些目标蛋白信号分子不表达，只有采用诱导剂刺激后才能够触发目标蛋白信号分子表达。如果不预先熟悉细胞或组织中目标蛋白信号分子表达特点，就会导致WB实验最后的目的条带结果呈现无信号或白片的情况。例如HeLa细胞和HAP-1细胞中的Cleaved-PARP信号表达，在有或没有Staurosporine诱导剂刺激下，WB实验最后的Cleaved-PARP目的条带结果就会表达或不表达（图8）。

图8  WB检测HeLa和HAP-1细胞中Cleaved-PARP表达

WB检测HeLa和HAP-1细胞中Cleaved-PARP表达，显示泳道1和3细胞未经Staurosporine诱导剂刺激，Cleaved-PARP没有表达；泳道2和4细胞经Staurosporine诱导剂刺激后，Cleaved-PARP显著表达。

2  样品处理的问题性

样品选取直接影响WB实验的可靠性、可重复性和准确性。然而，样品处理好也是确保实验结果完全呈现的关键步骤。WB实验中细胞或组织样品处理存在问题会导致样品中的目标蛋白信号分子有下面表现。

2.1  细胞或组织中目标蛋白信号分子量过低或降解

样品蛋白含量过低除了前述的可能是选取的细胞或组织中目标蛋白信号分子不表达或表达低外，存在两种情况。一种情况是，细胞或组织样品制备过程中，细胞裂解不充分、大部分蛋白在细胞内未释放出来，组织研磨/匀浆不充分、蛋白无法有效溶出，结果样品蛋白损失过多；另一种情况是，样品在采集、处理或储存过程中，没有在低温环境下操作，或没有加入足够的蛋白酶抑制剂，结果样品蛋白降解；籍此就会导致WB实验最后的目的蛋白信号分子条带结果呈现无信号或缺失。 例如，我们用IntactProtein™ 全能型蛋白抽提试剂盒（Cat#415）和RIPA buffer同时抽提HeLa细胞中的总蛋白，WB实验（上样量30 μg）检测mTOR蛋白表达。结果表明，RIPA buffer裂解不充分，蛋白未充分释放，信号较弱（图9）。

图9  WB检测mTOR蛋白在HeLa细胞中表达

2.2  细胞或组织中目标蛋白信号分子变性不充分

在细胞或组织样品处理过程中，如果加热时间不足或温度不够，目标蛋白信号分子不能完全变性或变性不充分，其在凝胶中的迁移率会受影响，就会导致WB实验最后的目的蛋白信号分子条带形状不规则、模糊。

2.3  细胞或组织中目标蛋白与非目标蛋白信号分子混杂

细胞或组织样品制备过程中，如果细胞裂解液中存在未去除干净的细胞碎片、核酸等，导致样品中杂质过多与抗体发生非特异性结合；如果使用的抗体特异性不强，除了与目的蛋白结合外，还会与样品中其他结构相似的蛋白结合，即存在抗体交叉反应；籍此就会导致WB实验最后的目的蛋白信号分子条带结果呈现非特异性条带。

2.4  细胞或组织中目标蛋白信号分子浓度过高或聚集体

细胞或组织样品制备过程中，如果样品蛋白浓度过高，在凝胶中迁移时，由于分子之间相互干扰，迁移速度会不一致；如果样品储存条件不当或稀释过程操作不当，致使蛋白发生大小不一的聚集体，在凝胶中迁移速度也会不一致；因此，就会导致WB实验最后的目的蛋白信号分子条带结果出现拖尾现象。如图10所示，我们用WB检测AKAP8在HeLa细胞中表达，泳道1上样量15 μg，泳道2上样量30 μg，结果表明，蛋白浓度过高会导致拖尾现象。

 

图10  WB检测AKAP8在HeLa细胞中表达

3  善本生物解决方案

为了避免WB实验中因样品问题导致的异常结果，需要在样品的采集、处理、储存等各个环节严格按照标准操作流程进行，确保样品中的目标蛋白信号分子质量和稳定性。

善本生物推荐大家首先熟悉和认知样品中目标蛋白信号分子特性，可以通过https://www.proteinatlas.org/网站、Uniprot或参考文献等权威的数据库资源，查阅并确认目标蛋白信号分子表达量或参考善本生物说明书提供的阳性样本。如果使用已确认有目标蛋白信号分子表达的样品，且样品处理也无瑕疵，仍检测不出阳性信号或异常，可能是WB实验体系出了问题，善本生物已积累了一整套WB实验快速解决方案策略，可以为用户提供技术支持和服务，帮助减少试错成本。

WB实验是利用特异性抗体与凝胶电泳分离开的细胞或生物组织样品中分子量和带电荷不同的蛋白质信号分子在转印到NC膜或PVDF膜后，进行杂交结合、发光/显色、分析发光/显色的位置和强度/深浅，评估细胞或组织中目标蛋白信号分子的表达情况。在此特别值得一提的是，全球公认的用基因工程验证抗体特异性的金标准方法有基因沉默（knock-down，KD）或基因敲除（knock-out，KO），这两项技术分别在RNA和DNA水平使基因编码的目标蛋白信号分子消失。本公司通过独有的ShGE^TM基因沉默平台，运用我司独有的全能型细胞/组织裂解液试剂盒处理制备细胞或组织样品，并通过优化的高通量WB实验体系，已经推出1500多种经过KD验证的高特异性抗体、慢病毒和细胞裂解物产品，善本生物技术优势和产品将为生命科学/生物医学基础研究、CRO临床实验和生物医药开发提供可靠的资源和服务。欢迎广大用户咨询和洽谈合作。