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今天为大家介绍1项2024年由哈佛大学团队开发并发表在《Nature Biotechnology》期刊上的新型基因编辑技术—点击编辑（Click Editing）。这项技术为遗传病治疗、农业育种等领域提供了更安全、灵活的基因编辑工具，也为基因组工程领域带来了全新的可能性。

什么是点击编辑?

点击编辑是将DNA聚合酶（DNA-dependent polymerases，DDPs）、HUH内切核酸酶（HUH endonucleases，HUHes）和Cas9切口酶（Cas9 nickase，nCas9）巧妙地结合，实现精准基因组编辑或修饰。点击编辑使得研究人员在不产生有害双链断裂的情况下，精确地向基因组中引入特定的修改。相比于传统的CRISPR-Cas9技术系统，点击编辑显著降低了不需要的插入和删除，即不需要的基因序列发生的插入或缺失改变（indels）以及染色体重排的风险。

点击编辑工作原理

点击编辑技术系统相当精妙！其工作原理可以简要概括：首先，使用经过修饰的nCas9切割DNA的一条链而不是两条链；其次，利用系统中HUHes与单链DNA形成共价键；最后，由系统中DDPs负责合成新的DNA（图1）。具体步骤如下（图1）：

1、RNA引导的nCas9被导向目标基因组位点并在非靶链上产生一个缺口；

2、HUHes与携带编辑信息的“点击DNA（click DNA，clkDNA）”模板形成共价键，将其锚定在目标位点上；

3、clkDNA的引物结合位点（primer binding site，PBS）与基因组的非靶链配对；

4、DDPs使用clkDNA作为模板，合成包含所需编辑的新DNA链；

5、通过DNA修复机制，编辑被整合到基因组中。

值得一提的是，以上整个过程不依赖于细胞周期特异性的修复机制，因此可以在多种细胞类型中高效运作（图1）。

点击编辑技术优势

点击编辑相较于现有基因编辑技术具有明显优势，体现在：

1、点击编辑避免了双链DNA断裂，这类断裂常导致不可预测的基因组变化、p53激活和细胞周期阻滞。

2、点击编辑不依赖于同源定向修复（homologous directed repair，HDR），因此不受细胞周期的限制；

3、与碱基编辑器相比，点击编辑能够引入多种类型的修改，包括碱基替换、插入和删除，而不仅限于特定类型的核苷酸变化；

4、点击编辑使用简单的DNA寡核苷酸作为模板，这些寡核苷酸易于合成、价格低廉且化学稳定性好；

5、研究者可以快速筛选不同的模板设计，无需复杂的克隆步骤，大大加速了优化过程。

点击编辑实验结果

研究团队在多种人类细胞类型中测试了点击编辑系统，结果令人印象深刻。

图1概述了点击编辑技术系统工作原理与组件。将猪环状病毒2（porcine cyclic virus 2，PCV2）的HUHes和nCas9与大肠杆菌DNA聚合酶I（DDPI）的Klenow片段结合起来构建成一个点击编辑融合蛋白（click editor，CE），即包含nCas9、HUHes和DDPs；测试了多种HUHes和DDPs，发现PCV2的HUHes与大肠杆菌DDPI的Klenow片段组合效率最高。当CE与两个gRNA共转染时，编辑效率显著提高，达到了近10%的精确编辑率。

 

图1  点击编辑技术系统工作原理及点击编辑融合蛋白构建

接着研究团队展示了clkDNA参数筛选和优化（图2）。通过系统地测试不同长度的PBS和聚合模板（polymerization template，PT）组合，形成高通量筛选方法，籍此能快速优化clkDNA参数，并在多个靶点上实现了约15%的编辑效率；较长的PBS（>10 nt）和PT更有效，且适当的化学修饰能进一步提高编辑效率在多个基因位点的筛选（图2）。

 

图2  clkDNA参数筛选和优化

继后，研究团队在clkDNA中添加额外的静默突变，可以显著提高编辑效率，最高可达24.7倍（图3）；添加的额外突变可以帮助规避细胞内的DNA错配修复系统，进而保留所需的基因编辑（图3）；此外，研究团队还设计了64种不同的含有额外碱基变化的clkDNA，系统地评估了不同位置和类型的错配对编辑效率的影响（图3），为未来设计最佳clkDNA提供了基础数据。

图3  通过clkDNA修饰规避DNA修复

为了明晰点击编辑技术特点和优势，研究团队将点击编辑与先导编辑（prime editing，PE）作了对比实验。观察到CE1与PE1表现相当甚至更好，但与优化的PE2或PE3相比效率较低，这可能归因于PE2或PE3使用了经过工程改造的RT结构域（图4）；脱靶分析可见，CE1在脱靶位点产生的indels显著低于Cas9核酸酶，且未检测到精确脱靶编辑，意味着CE1具有高保真度的特性（图4）；此外，实验还排除了HUHes与基因组中潜在结合位点相互作用的风险（图4）。

 

 

图4  点击编辑与先导编辑比较和脱靶分析

 

最后，研究团队探索了不同的CE架构设计，包括融合型、非融合型和招募型结构，并在不同人类细胞系中测试CE的编辑效率（图5）；开发了mRNA递送方式，可在HEK293T、HeLa和HCT116细胞中实现高达25.2%的编辑效率（图5）；这些数据支持点击编辑技术的广泛适用性以及向体内应用推进的潜力。另外，通过对29个潜在脱靶位点的分析，发现点击编辑产生的脱靶编辑极少，明显低于传统的Cas9核酸酶（图5），提示点击编辑可能是一种高度特异性的基因组编辑方法。

综上系列实验结果清晰地展示了，点击编辑技术系统创新性地将nCas9切割DNA的一条链能力、HUHes的共价连接能力和DDPs的高保真复制能力巧妙地结合，实现精确基因组编辑；通过系统的参数优化和多种细胞系验证，证明该技术的有效性和通用性。

 

图5  CE构建优化及在不同细胞中的应用

未来的应用前景

由于点击编辑技术系统基于模块化设计，研究人员可以深入操作、优化系统的各个组件，包括开发更高效的DDPs、探索新的HUHes变体以及优化clkDNA的设计和化学修饰。这项技术的灵活性和精确性使其有望用于各种应用，从基础研究到疾病建模，再到潜在的基因治疗。随着进一步的优化和发展，点击编辑可能成为基因组工程领域的重要工具，为解决复杂的生物学和医学问题提供新的思路和方法。

总结

点击编辑技术代表了基因组编辑领域又一重大突破；它结合了高精度、多功能性和安全性，有望在生物技术和医学研究中发挥重要作用；随着更多研究的进行及成果的形成，期待着这项技术能为更多疾病的治疗带来新的希望。

关键词

点击编辑；DNA聚合酶（DDPs）；HUH内切核酸酶（HUHes）；Cas9切口酶（nCas9）；点击DNA（clkDNA）；基因组